包括48 個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑
請?jiān)谑褂们巴ㄗx操作說明書
1. 試劑盒組成
￭ 25 管 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)
￭ 2 x 520 μl FMDVA-1 擴(kuò)增反應(yīng)試劑球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)
￭ 2 x 25 μl 陽性對照 (Positive control; -20oC 保存)
￭ 1 x 10μl Taq酶(Taq Polymerase; -20oC 保存)
保存條件
試劑球需置干燥劑中保存在4oC，已融解的試劑球則需保存在零下20oC。其他試劑需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各試劑并充分混合，不要旋渦振蕩含酶的擴(kuò)增反應(yīng)試劑。
2. 操作程序
擴(kuò)增反應(yīng)試劑的準(zhǔn)備
1. 計(jì)算所需的反應(yīng)數(shù)量 (n)
2. 需要溶解的試劑球 = 0.5 x n
3. 每個(gè)試劑球需要 40 μl 試劑球溶液及0.4μl Taq酶。
4. 在冰上溶解試劑，并輕輕扣擊充分混合 (不要旋渦振蕩含酶的試劑)
反應(yīng)的準(zhǔn)備
1. 實(shí)驗(yàn)中除從樣本中獲得的RNA 模板外，我們還建議設(shè)置陽性和陰性（水）對照
2. 按照下表準(zhǔn)備擴(kuò)增反應(yīng)試劑：
|
反應(yīng)組分 |
每個(gè)反應(yīng)體積 |
|
擴(kuò)增反應(yīng)試劑 |
20 μl |
|
樣品RNA |
5 μl |
|
總體積 |
25 μl |
注意:
￭ 實(shí)驗(yàn)時(shí) RNA 應(yīng)放在冰上
￭ 陽性對照建議加5 μl 試劑盒提供的陽性對照。
￭ 建議PCR 過程中檢測樣本設(shè)置重復(fù)，以便得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
￭ 為了驗(yàn)證陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是由于樣本中存有PCR 抑制物而導(dǎo)致PCR 呈陰性反應(yīng)，我們建議在測試樣本中加1 μl 的陽性對照作為spiking 對照 (spiking control)，同時(shí)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。
PCR 循環(huán):
|
數(shù)據(jù)收集位點(diǎn)（FAM染料） ABI7700 ABI7300 其它儀器 |
|
1 個(gè)循環(huán) 42oC 30 分鐘 * |
|
95oC 10 分鐘 * |
|
5 個(gè)循環(huán) 95oC 10 秒 * |
|
45oC 30 秒 * |
|
72oC 60 秒 * |
|
40 個(gè)循環(huán) 95oC 15 秒 * |
|
58oC 60 秒 * * * |
( * 表示位點(diǎn)收集FAM讀數(shù))
3. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有幾個(gè)可能性：
1. 樣本中不存在目的片段；
2. 樣本中目的片段的量低于檢測值；
3. 樣本中存有 PCR 抑制物。
試劑盒中設(shè)計(jì)spiking 對照 (spiking control) 是為了確定沒有發(fā)生PCR 抑制。
如果樣本中加了陽性對照以后擴(kuò)增結(jié)果的Ct值接近40（或者接近陰性對照的Ct值），說明樣本中存在PCR 抑制物，那幺此次陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不能作為正確的結(jié)果，需要重新開始樣本核酸的提取和PCR 擴(kuò)增。北京祥龍環(huán)宇生物技術(shù)有限公司
北京市朝陽區(qū)朝陽路財(cái)滿街財(cái)經(jīng)中心9號(hào)樓1單元702室 郵編100025
電話 010-65567512 傳真010-65563420