在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此必然帶來(lái)一些特殊的問(wèn)題，我們必須充分地重視。
1、要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定的比例內(nèi)互溶，超出一定的范圍后就不會(huì)互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸銨（pH5.16）做梯度洗脫，乙腈含量超過(guò)70%時(shí)就會(huì)出現(xiàn)不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%時(shí)就會(huì)分層等。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖溶液混合時(shí)還可能析出鹽的結(jié)晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。
2、梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辯認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭上后會(huì)被強(qiáng)的溶劑洗脫出來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止溶劑混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。
3、混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因此在梯度洗脫時(shí)常會(huì)出現(xiàn)壓力變化，例如純水或甲醇的粘度都比較小，但是當(dāng)二者以相近的比例混合時(shí)粘度會(huì)增大很多，此時(shí)的柱壓是純水或甲醇為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱所能承受的最大壓力。
4、每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始的狀態(tài)。需讓10～30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。