為此，每個國家和地區(qū)的食品安全機構(gòu)都制定了非常嚴(yán)格的真菌毒素安全標(biāo)準(zhǔn)。既然有標(biāo)準(zhǔn)，就需要對應(yīng)的檢測技術(shù)進(jìn)行配合，否則再嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)也只是一紙空文。然而，真菌毒素的檢測卻十分困難。以谷物中的多真菌毒素檢測為例，谷物中有許多天然成分都是LC-MS/MS分析的干擾物。雖然蛋白質(zhì)和淀粉可通過QuEChERS提取過程中的層析、沉淀和離心步驟去除，但是大量脂肪和卵磷脂(磷脂)仍會隨目標(biāo)物霉菌毒素被共同提取出來。這些共提物會干擾LC-MS分析、污染色譜柱和UPLC系統(tǒng)、質(zhì)譜儀。傳統(tǒng)方法主要采用正己烷脫脂或使用反相吸附劑(如硅膠C18)去除提取物中的脂肪。盡管這些技術(shù)可有效去除脂肪，但都無法去除磷脂。
因此，我們設(shè)計了一種方法，應(yīng)用了沃特世最先進(jìn)的固相萃取產(chǎn)品Oasis系列。該方法使用Oasis PRiME HLB小柱進(jìn)行通過式凈化以去除脂肪和磷脂；通過dSPE(分散SPE)凈化去除殘留的糖類和其它極性物質(zhì)。應(yīng)用上述凈化方案可以得到滿意的回收率。
樣品前處理
樣品提取：取2.0 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入10 mL水溶液，漩渦混合30 s，再加入10 mL甲酸/乙腈(10:90)溶液，置于自動振蕩器中振蕩60 min，加入QuEChERS鹽包(用于CEN方法的DisQuE提取鹽包，部件號186006813)后大力振搖1 min，在3200 rpm的轉(zhuǎn)速下，離心5 min。
樣品凈化：將Oasis PRiME HLB小柱(3 cc，150 mg，部件號186008717)安裝在預(yù)先清潔過且設(shè)置為最小真空度(大約2 psi)的真空萃取裝置上。無需執(zhí)行小柱活化步驟。取約0.4 mL上清液，使其通過Oasis PRiME小柱并棄去濾液。然后再取1 mL上清液，再次通過小柱并收集濾液。然后將收集到的流出液轉(zhuǎn)移到含有混合吸附劑的2 mL dSPE管(部件號186008081)中。在13500 轉(zhuǎn)/分鐘下離心1 min，取500 μL上清液，在溫和的氮氣流中揮干，然后復(fù)溶于250 μL乙腈/水(15:85)中。
實驗結(jié)果
基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)
每種化合物使用空白基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.1 μg/L - 5 μg/L范圍內(nèi)6 個不同濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2 > 0.99，基質(zhì)效應(yīng)見下表。
方法回收率和穩(wěn)定性
使用面粉和玉米樣品進(jìn)行添加回收實驗。三個不同的添加濃度分別為0.4 μg/kg、1 μg/kg、5 μg/kg(以黃曲霉AFG1 計)，每個添加濃度平行三次重復(fù)測定，平均回收率及RSD 結(jié)果見下表。
方法LOQ與限量的比較
凈化效果
下圖為Oasis PRiME小柱去除磷脂的效率的比較色譜圖；顯示了使用Oasis PRiME小柱成功去除了95%以上的磷脂和80%以上的總脂肪。
通過這個實驗，我們不難看出：
采用Oasis® PRiME HLB小柱的簡單通過式凈化方案能夠去除提取液中80%以上的總脂肪和95%以上的磷脂，同時使用混合吸附劑的dSPE 凈化管能有效去除提取液中的極性雜質(zhì)，保證最小的基質(zhì)效應(yīng)。
本實驗嘗試了多款色譜柱，最終選擇使用能夠有效分離12種真菌毒素，尤其是同分異構(gòu)體3-乙?；撗跹└牭毒┐己?5-乙?；撗跹└牭毒┐嫉腁CQUITY UPLC® CSH Fluoro-Phenyl色譜柱。
本方法為LCMSMS測定，其中黃曲霉毒素B1(面粉限量5 ng/g玉米限量20 ng/g)在5 ng/g添加濃度下玉米和面粉的回收率分別為83.1%和102.7%；OTA在限量濃度下，玉米和面粉的回收率分別為67.9%和85.8%；ZEN(限量為60 ng/g)在125 ng/g的添加濃度下玉米和面粉的回收率分別為47.9%和69.1%；DON(限量為1000ng/g)在500 ng/g 的的添加濃度下玉米和面粉的回收率分別為92.4%和100.2%。
本方法使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，因伏馬毒素沒有找到純陰性樣品，所以回收率數(shù)據(jù)和和方法定量限無法計算,因此未在此應(yīng)用中列出。
