“瘦肉精”、“速成雞”、“毒雞蛋”等突發(fā)性食品安全事件的發(fā)生往往都與獸藥殘留有著密不可分的聯(lián)系。對此，美國、歐盟和中國等主要地區(qū)和國家都出臺了十分嚴(yán)格的法規(guī)，力圖通過對獸藥殘留的嚴(yán)格規(guī)定來保障食品安全。以我國為例，農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定了動物性食品中獸藥最高殘留量，包括動物性食品允許使用，但不需要制定殘留限量的藥物 81種；已批準(zhǔn)的動物性食品中最高殘留限量規(guī)定 92種；允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出的藥物 9種；禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出 40種。
在所有的獸藥使用中，抗生素類和激素類獸藥的使用量占到了整個獸藥使用量的較大比重，因此，抗生素和激素類獸藥殘留問題相對較為嚴(yán)重?？股仡惈F藥殘留對食品安全性的危害主要有以下幾個方面：導(dǎo)致人體細(xì)菌的耐藥性、使部分人群發(fā)生過敏反應(yīng)及變態(tài)反應(yīng)、嚴(yán)重?fù)p害動物及人機體免疫細(xì)胞功能、引起畜禽內(nèi)源性感染和二重感染、對人體產(chǎn)生慢性毒害作用。而性激素是人體內(nèi)存在的正常物質(zhì)，若從體外大量攝入性激素，則會引起機體內(nèi)激素分泌活動的減少，長期攝入還會造成體內(nèi)激素比例失調(diào)。此外，性激素類固醇屬于弱致癌物質(zhì)，長期使用會危及人體健康，甚至有致命危害。
現(xiàn)有的一些標(biāo)準(zhǔn)對動物源性食品中的抗生素類化合物，如：羧芐西林（2 µg/kg）、頭孢哌酮（2 µg/kg）、苯丙酸諾龍（1 µg/kg）及激素類化合物己烷雌酚（0.4 µg/kg）已經(jīng)有了相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，但對這些禁用藥物更高靈敏度的檢測和監(jiān)控依然具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。而目前在所有獸藥檢測中，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是應(yīng)用較為廣泛，發(fā)展也較為成熟的技術(shù)之一。
本文建立了一種通過正、負(fù)極性切換，同時分析檢測這5種化合物的高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用分析方法，兼顧了不同化合物化學(xué)性質(zhì)的差異，對于獸藥及激素殘留進(jìn)行痕量檢測，為居民關(guān)心的食品安全問題提供更好的保障。
實驗部分
液相條件
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色譜柱： |
Waters HSS T3 (2.1 x 50 mm, 1.8 µm) |
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流動相： |
A: H2O; B: ACN |
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流速： |
0.5 mL/min |
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柱溫： |
40 ?C |
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進(jìn)樣量： |
5 µL |
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時間 (min) |
流速 (mL/min) |
A% |
B% |
梯度曲線 |
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初始 |
0.5 |
95 |
5 |
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0.6 |
0.5 |
95 |
5 |
6 |
|
2.5 |
0.5 |
5 |
95 |
6 |
|
3.5 |
0.5 |
5 |
95 |
6 |
|
3.6 |
0.5 |
95 |
5 |
6 |
|
5 |
0.5 |
95 |
5 |
6 |
表1. 流動相洗脫程序。
質(zhì)譜條件
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離子源： |
ESI+/ESI- |
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采集方式： |
MRM |
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離子源溫度： |
150 ?C |
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脫溶劑溫度： |
550 ?C |
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脫溶劑氣流速： |
1100 L/H |
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錐孔氣： |
150 L/H |
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碰撞氣流速： |
0.15 mL/min |
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化合物 |
電離模式 |
母離子 |
子離子 |
錐孔電壓 |
碎裂能 |
|
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羧芐西林 |
Carbennicilin |
ESI+ ESI+ |
379 |
160 (定量) 220 (定性) |
6 6 |
12 12 |
|
頭孢哌酮 |
Cefoperazone |
ESI+ ESI+ |
646 |
143 (定量) 530 (定性) |
30 30 |
36 10 |
|
頭孢曲松 |
Ceftriaxone |
ESI+ ESI+ |
555 |
125 (定量) 167 (定性) |
22 22 |
64 32 |
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苯丙酸諾龍 |
Nandrolone phenylpropionate |
ESI+ ESI+ |
407 |
105 (定量) 257 (定性) |
30 30 |
28 15 |
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己烷雌酚 |
Hexoestrol |
ESI- ESI- |
269 |
119 (定量) 134 (定性) |
38 38 |
38 16 |
表2. 各化合物MRM信息。
結(jié)果與討論
方法的優(yōu)化
因五種激素化合物的性質(zhì)各不相同，羧芐西林在甲酸銨系統(tǒng)里色譜沒保留（如圖1所示），而頭孢曲松在甲酸系統(tǒng)里幾乎沒有響應(yīng)信號（如圖2所示），而其他化合物 在甲酸系統(tǒng)里信號明顯增強。故為兼顧所有化合物，最終流動相體系選擇純水作為水相流動相，使每種化合物都有一個相對不錯的表現(xiàn)。
圖1. 羧芐西林在不同系統(tǒng)的色譜保留。
圖2. 頭孢曲松在不同系統(tǒng)的信號響應(yīng)。
儀器靈敏度
圖3為0.01 ng/mL濃度的混標(biāo)溶液，各個化合物的定量MRM離子對的響應(yīng)情況（柱上進(jìn)樣量50 fg），可見，頭孢曲松基本已達(dá)到最低定量限，而其他四個化合物的儀器靈敏度還可以向下延伸，達(dá)到幾個fg。如果使用不同的方法，分別分析這5個化合物，選擇各自更適合的流動相系統(tǒng)，儀器靈敏度還可以更高。
圖3. 0.01 ng/mL化合物混標(biāo)溶液中各化合物的信號響應(yīng)，進(jìn)樣量5 µL。
線性范圍
五種化合物在0.01-10ppb范圍內(nèi)，線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R2皆大于0.99,詳見下圖。
穩(wěn)定性的考察
0.1 ng/mL的混標(biāo)溶液，進(jìn)樣5 µL，柱上進(jìn)樣量500 fg，連續(xù)進(jìn)樣6針，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3所示。
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化合物 |
%RSD |
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羧芐西林 |
Carbennicilin |
2.47 |
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頭孢哌酮 |
Cefoperazone |
3.27 |
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頭孢曲松 |
Ceftriaxone |
2.64 |
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苯丙酸諾龍 |
Nandrolone phenylpropionate |
1.59 |
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己烷雌酚 |
Hexoestrol |
1.80 |
表3. 5種化合物混標(biāo)，500 fg柱上上樣量，連續(xù)6針進(jìn)樣的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。
結(jié)論
本實驗中使用UPLC/XEVO TQ-XS 建立了一種同時檢測羧芐西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、苯丙酸諾龍、己烷雌酚等5種化合物的定量分析方法；在兼顧這5種化合物不同化學(xué)性質(zhì)的前提下，達(dá)到了較高的靈敏度，遠(yuǎn)低于目前行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對其殘留限量的要求，數(shù)據(jù)穩(wěn)定重現(xiàn)，為居民日益關(guān)注的食品安全問題加上了又一道安全防線。
