【發(fā)布單位】 農業(yè)部
【發(fā)布文號】 農業(yè)部公告第2078號
【發(fā)布日期】 2014-03-12
【生效日期】
【效 力】
【備 注】
【發(fā)布文號】 農業(yè)部公告第2078號
【發(fā)布日期】 2014-03-12
【生效日期】
【效 力】
【備 注】
根據《獸藥管理條例》和《獸藥注冊辦法》規(guī)定，我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法，現予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行。
特此公告。
附件：1.口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法
2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
農業(yè)部
2014年3月12日
附件1
口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中，置50±5℃水浴90分鐘，然后在4℃條件下，以15000 g離心10分鐘，取水相5.0 ml，按現行《中國獸藥典》一部附錄進行檢驗。每頭份疫苗中內毒素含量應不高于50 EU。
附件2
口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
取1瓶疫苗恢復至室溫，在3個1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復溶后，按附注進行檢驗。每毫升疫苗總蛋白含量應不高于500μg。
附注：口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
1.方法與原理
本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測。本法系福林酚法(lowry法)，依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質－銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應。在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
2.試劑與儀器
2.1試劑丙酮（分析純）、無菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒；
2.2設備酶標儀（全波長），“Μ”型96孔板，卡介苗注射器，單通道和多通道移液器，渦旋震蕩儀，酶標板振蕩器等。
3.操作步驟
3.1標準系列稀釋液制備將商品化試劑盒內標準牛血清白蛋白（2mg/ml母液），按下表依次稀釋。
|
編號 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
母液（μl） |
0 |
5 |
25 |
50 |
100 |
150 |
200 |
300 |
400 |
|
去離子水（μl） |
400 |
395 |
375 |
350 |
300 |
250 |
200 |
100 |
0 |
|
終濃度（μg/ml） |
0 |
25 |
125 |
250 |
500 |
750 |
1000 |
1500 |
2000 |
3.2檢驗疫苗處理取1瓶疫苗恢復至室溫搖勻后，在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮，充分混勻，室溫放置10分鐘，在4℃條件下，以15000 g離心15分鐘。吸棄液相，沉淀物用400μl丙酮洗滌2次，室溫干燥約15分鐘，加50μl去離子水復溶備用。
3.3反應板加樣與讀數
3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標準溶液40μl，以及三重復待檢疫苗樣品40μl，分別加入到96孔板內。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內試劑，立即用振蕩器混勻30秒；
3.3.2封膜，室溫孵育10分鐘；
3.3.3各孔內分別加入20μl 1倍酚試劑（試劑盒內為2倍，用前用去離子水現稀釋），立即用振蕩器混勻30秒；
3.3.4封膜，室溫孵育30分鐘；
3.3.5酶標儀測定750nm吸光值，保存讀數。
3.4數據處理
根據系列標準蛋白稀釋液的濃度（0μg/ml～2000μg/ml）和750nm吸光值，使用EXCEL以吸光值為X軸，以蛋白標準濃度為Y軸，繪制標準曲線，依據趨勢線求得多項式，其多項式R2≥0.98。
將被檢樣品的吸光值代入標準蛋白獲得的多項式，計算樣品中蛋白含量，根據取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1，免疫劑量為2ml時，100μl疫苗經丙酮沉淀后用50μl去離子水復溶，測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度，或2ml疫苗中蛋白濃度。結果判定時，將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。
3.5結果判定
若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg，判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。
3.6檢測數據處理舉例
3.6.1收集數據如表所示
|
Value |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
A |
0.102 |
0.149 |
0.336 |
0.504 |
0.836 |
1.122 |
1.334 |
1.702 |
1.923 |
-- |
-- |
-- |
|
B |
0.677 |
1.722 |
0.252 |
1.116 |
2.167 |
1.020 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
C |
0.640 |
1.704 |
0.230 |
1.050 |
2.195 |
0.962 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
D |
0.641 |
1.716 |
0.225 |
1.061 |
2.175 |
1.012 |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
E |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
F |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
G |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
H |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
-- |
上述表格中，A1-A9為系列稀釋的標準牛血清白蛋白溶液，A1至A9蛋白濃度依次增高；B、C、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值，B1-B6為6批不同批次疫苗樣品，每一列為同一疫苗樣品三個重復。
3.6.2繪制標準曲線：將上表中數據復制到EXCELL表格中，
采用EXCEL程序，選中1-9列對應的兩行數據→“插入”→“散點圖”，選擇“帶平滑線和數據標記的散點圖”，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢線”→“其他趨勢線選項”，選中“多項式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標準曲線可信。每一塊96孔板應設一組標準并繪制相應標準曲線。
|
Value |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
OD750 |
0.102 |
0.149 |
0.336 |
0.504 |
0.836 |
1.122 |
1.334 |
1.702 |
1.923 |
|
蛋白濃度μg/ml |
0 |
25 |
125 |
250 |
500 |
750 |
1000 |
1500 |
2000 |
采用EXCEL程序，選中1-9列對應的兩行數據→“插入”→“散點圖”，選擇“帶平滑線和數據標記的散點圖”，得到以750nm吸光值為X軸，以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢線”→“其他趨勢線選項”，選中“多項式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標準曲線可信。每一塊96孔板應設一組標準并繪制相應標準曲線。
3.6.3數值計算
以樣品測定OD750值為X，代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423，Y為蛋白濃度，以表中第一批疫苗測定結果為例。該疫苗三重復測定的OD750數據（X）分別為：0.677、0.640、0.641，代入公式計算蛋白含量（Y）分別為：334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml，該數據為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計算三重復數值的平均值（AVERAGE）為316μg/ml，標準差（STDEV.P）為13.1，變異系數為4.15%（標準差/平均值*100%），將每毫升水相抗原中總蛋白含量，除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量，該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法，可計算其他樣品的總蛋白含量。
3.6.4結果判定
同一樣品不同重復間變異系數應小于5.3%，否則試驗不成立，應重做。若測定值小于或等于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規(guī)定；若測定值大于500μg/ml，則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規(guī)定。