近日,中國農(nóng)科院植保所抗病蟲作物生態(tài)安全評價與利用創(chuàng)新團隊在植物生物學領(lǐng)域的國際著名期刊《植物細胞》(The Plant Cell)上在線發(fā)表了題為“Efficient in situ epitope tagging of rice genes by nuclease-mediated prime editing”的研究論文,該研究借用基于CRISPR/Cas核酸酶的引導編輯系統(tǒng),通過微同源介導末端連接途徑實現(xiàn)了水稻多個內(nèi)源基因的高效精準標記,為水稻內(nèi)源基因標簽研究提供了全新的編輯策略。
標簽蛋白便利于科學家研究蛋白質(zhì)的互作關(guān)系、信號通路和分子機制,被廣泛應(yīng)用于生命科學領(lǐng)域的分子生物學、細胞生物學和生物化學研究中。相對于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)介導的外源標簽蛋白研究,其過量表達有時會造成研究結(jié)果的不可靠性,通過基因編輯技術(shù)直接標簽內(nèi)源靶基因創(chuàng)制材料,研究結(jié)果更能反映靶基因在細胞內(nèi)參與的生理生化過程和實際功能。長期以來,如何突破高效的植物內(nèi)源基因標簽技術(shù)一直都是生物技術(shù)研究人員關(guān)注的重要課題。
在該研究中,研究人員首先借助多種優(yōu)化策略在水稻上建立了高效的引導編輯系統(tǒng),測試靶位點的編輯效率高達95.83%。進一步探索了基于CRISPR/Cas核酸酶的引導編輯系統(tǒng),通過不同DNA修復途徑(非同源介導的末端連接/NHEJ和微同源介導的末端連接/MMEJ)在水稻內(nèi)源基因精準標記中的潛力。
結(jié)果表明兩種策略均能實現(xiàn)水稻內(nèi)源基因的精準FLAG標記,但MMEJ介導的 NM-PE策略在精準性和效率上比NHEJ介導的 NN-PE策略更優(yōu)。此外,借助的SpRY和ScCas9核酸酶,松弛型的引導編輯器通過NM-PE策略成功實現(xiàn)內(nèi)源基因OsMPK3、OsMPK6、OsMPK7、OsMPK10、OsMPK11的精準標記,編輯效率高達70.83%,大大擴展了NM-PE標簽策略在水稻基因組中的應(yīng)用范圍。最后,研究人員探索了NM-PE在水稻內(nèi)源雙基因標簽中的潛力,結(jié)果表明后代基因編輯群體擁有大量單、雙基因精準標簽植株以及基因敲除植株。綜上,基于CRISPR/Cas核酸酶介導的雙鏈DNA切割和微同源介導的末端連接途徑的NM-PE策略,可以實現(xiàn)水稻靶基因的多核苷酸精準操作、精準標簽及敲除等,在未來水稻蛋白標記組學研究、基因功能研究和遺傳改良方面具有很大的潛力,也為其它農(nóng)作物和經(jīng)濟作物相關(guān)研究提供的全新的思路。
中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所博士研究生李雪琪(海南專項)和博士研究生張素杰為本文共同第一作者,周煥斌研究員為通訊作者,團隊多名成員共同合作完成,北京農(nóng)林科學院李少芳研究員、挪威生物經(jīng)濟研究所Carl Spetz研究員、青島農(nóng)業(yè)大學黃金光教授、中國農(nóng)科院植保所周雪平教授也參與了相關(guān)研究工作。該研究得到了農(nóng)業(yè)生物育種重大專項、國家重點研發(fā)計劃、中國農(nóng)業(yè)科學院南繁專項基金、海南省種業(yè)重點實驗室和中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程等項目的支持。
論文鏈接:https://doi.org/10.1093/plcell/koae316