近日，農業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室、湖北洪山實驗室、華中農業(yè)大學動物育種與健康養(yǎng)殖前沿科學中心晏向華教授團隊研究成果以“Precise digital bacteria enumeration and antibiotic susceptibility testing via a portable vibrating capillary-based droplet platform”為題在Sensors and Actuators B: Chemical發(fā)表，研究開發(fā)了一種基于微流控液滴技術的數字化活細菌計數與抗生素敏感性測試新方法。同時研究人員還研制了一種豬血清中賴氨酸濃度的即時檢測裝置，相關研究成果以“Point-of-care testing for lysine concentration in swine serum via blue-emissive carbon dot-entrapped microfluidic chip”為題在Animal Nutrition發(fā)表。

 

　　抗生素耐藥性是人類健康的重大威脅，傳統(tǒng)的抗生素敏感性測試方法如肉湯稀釋法、紙片擴散法等存在檢測時間長、樣品消耗量大等不足，無法有效滿足快速診斷的需求。研發(fā)快速、準確、便攜的細菌抗生素敏感性測試方法與平臺，對于生豬健康養(yǎng)殖過程中規(guī)定的“飼料端無抗、養(yǎng)殖端減抗、產品端無抗”的抗生素含量和耐藥性細菌產生的即時檢測具有重要意義。

 

　　液滴數字化計數分析（droplet digital counting）是將原始樣本分散至大量等體積的納升級微液滴中，每個液滴作為一個獨立的生物反應器，通過對包含待測目標的液滴（陽性液滴）進行識別和計數，根據泊松分布可實現待測目標的絕對定量。由于細菌被限制在納升級空間中生長，有利于自身及代謝產物的富集，數字化細菌分析與抗生素敏感性測試可以大大縮短信號檢測所需的孵育時間。微流控芯片是目前最常用的數字化離散平臺，然而現有芯片的制作與操作對專業(yè)設備、技能及成本的要求較高，且微液滴的體積和數量難以靈活調節(jié)，限制了數字化分析的動態(tài)范圍和精確度。

 

　　研究人員研發(fā)了一種聲波驅動的可控微液滴生成技術與平臺，該平臺僅由一根由壓電膜片控制的玻璃毛細管、一個便攜式信號發(fā)生器和一個液滴收集池組成，裝置簡單、操作簡便，且成本低廉。該液滴技術可高通量生成單分散微液滴，通過改變聲波信號參數，液滴體積從0.016 nL至26.4 nL連續(xù)、實時、靈活可調，可滿足多體積數字化細菌計數的需求。利用該技術，研究人員將活性指示劑刃天青與細菌共同包裹于兩種不同體積的微液滴中。細菌在液滴中繁殖會使指示劑反應并產生紅色熒光；當微液滴經過孵育后，內含活細菌的液滴可顯示熒光信號，而未包裹細菌或包裹死細菌的液滴則無明顯熒光信號。通過熒光成像，結合自主開發(fā)的圖像與數據處理程序，可快速實現陽性和陰性液滴的識別與統(tǒng)計，并根據泊松分布，計算出樣本中的活細菌濃度。該方法可在5×10 2 CFU/mL至1×10 7 CFU/mL的范圍內實現活細菌的快速、準確計數；且與單體積液滴相比，多體積液滴分析極大提高了計數的動態(tài)范圍和準確性。

 

　　研究人員進一步在液滴平臺上集成了一個3D打印旋轉進樣切換裝置，通過中央切換閥的旋轉，可實現不同樣品的靈活切換與液滴生成，滿足不同濃度抗生素處理與檢測的需求。將細菌、抗生素和指示劑共同包裹于液滴中，通過計算不同濃度抗生素處理下樣品中細菌的存活率，擬合得到抗生素濃度與細菌存活率的關系曲線，可以準確評估抗生素的最小抑菌濃度。該方法可將抗生素敏感性測試時間由傳統(tǒng)方法的20小時以上縮短至5小時，且通過微液滴體積的靈活調節(jié)可實現單個液滴中細菌濃度的精確設置，準確評估細菌初始接種濃度對抗生素敏感性測試結果的影響。

 

　　華中農業(yè)大學理學院丁馳竹副教授、碩士研究生劉越為共同第一作者，華中農業(yè)大學動科動醫(yī)學院何子怡副研究員、晏向華教授為共同通訊作者。該研究受到了國家自然科學基金、華中農業(yè)大學自主科技創(chuàng)新基金和農業(yè)微生物重大基礎設施項目的資助。

 

　　賴氨酸是生長豬必需氨基酸之一，也是玉米-豆粕型日糧的第一限制性氨基酸。在我國豆粕減量替代方案和低蛋白日糧技術推廣過程中，賴氨酸若缺乏會限制豬生長性能發(fā)揮，但過量補充賴氨酸不僅會造成浪費，還會影響精氨酸、組氨酸等其他氨基酸的吸收和轉運。由于賴氨酸缺乏或過量都有負面影響，而賴氨酸需求量是一個涉及多種因素的動態(tài)變化量，因此需要一種簡單有效的賴氨酸營養(yǎng)狀態(tài)評定方法。血液中賴氨酸濃度是賴氨酸營養(yǎng)狀況的直接反映，但現有的檢測方法依賴于氨基酸自動化分析儀，不能滿足現場快速檢測的要求。

 

　　研究人員首先研發(fā)了一種氮摻雜碳點作為檢測賴氨酸的熒光探針，該探針在紫外激發(fā)下能發(fā)出藍色熒光，且熒光強度隨賴氨酸濃度增加而增強，具有高的熒光量子產率、穩(wěn)定性、靈敏度和特異性。接下來，研究人員將該氮摻雜碳點包裹在水凝膠微結構中，作為核心檢測元件，設計了用于快速測定賴氨酸濃度的微流控芯片，將一次檢測所需的血清樣本量降至3 μL。試驗結果表明，利用熒光顯微鏡對該芯片拍照，根據熒光強度變化可以準確測量賴氨酸濃度。

 

　　最后，研究人員設計制作了一個成像附件，以提供穩(wěn)定的激發(fā)光和拍照環(huán)境，將微流控芯片和智能手機集成為便攜式的即時檢測平臺，通過用智能手機對微流控芯片拍照實現測量。該平臺只需3 μL豬血清樣品，檢出限小于16 μmol/L，滿足豬血清中賴氨酸濃度的正常范圍，檢測時間約3分鐘；具有操作簡單、反應迅速、成本低、采血量小、減輕豬應激等優(yōu)點，可用于豬賴氨酸營養(yǎng)狀態(tài)的動態(tài)監(jiān)測，為我國豆粕減量替代方案和低蛋白日糧技術策略下的精確飼料配方提供依據。

 

　　華中農業(yè)大學理學院丁馳竹副教授為第一作者，動科動醫(yī)學院晏向華教授為通訊作者。該研究受到了國家自然科學基金的資助。

 

　　【論文1英文摘要】Antibiotic resistance can lead to multidrug-resistant superbugs and threaten global health, putting forward a high demand for accurate and fast antibiotic susceptibility testing （AST）。 Conventional AST methods are labor-intensive and time-consuming, far from meeting the requirement for rapid clinical decision-making. Here, we develop a portable vibrating capillary-based droplet platform for precise digital bacteria enumeration and rapid AST. Multi-volume droplets encapsulating bacteria with or without antibiotics are generated on demand, and the elevated fluorescence from resazurin reduction is measured, which corresponds to the growing bacteria. Automated data analysis is achieved by a self-developed image processing program. Multi-volume droplet digital counting allows precise bacteria enumeration over a wide dynamic range spanning more than 4 orders of magnitude. Droplet digital AST of ampicillin against E. coli demonstrates that it is feasible for accurately assessing the minimum inhibitory concentration and investigating the inoculum effect, with the assay time reduced to 5 hr. In sum, this method is easy to operate, cost-effective, with high accuracy and short time-to-result, which is highly promising for rapid and precise assessment of antimicrobial susceptibility in resource-limited settings.

 

　　論文1鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400522018974

 

　　【論文2英文摘要】Lysine is one of the essential amino acids and plays a vital role in the growth, development and health of pigs. Blood lysine concentration is a direct indication of lysine status; however, current methods can not satisfy the demands for rapid and on-site lysine concentration measurement of swine serum. Here, we developed blue-emissive nitrogen-doped carbon dots as a fluorescence probe for the determination of lysine with high fluorescence quantum yield, stability, sensitivity and specificity. The carbon dots were entrapped within hydrogel microstructures to fabricate microfluidic chips for rapid assay for lysine quantification. We further developed an imaging attachment to integrate the microfluidic chip and a smartphone into a portable point-of-care testing platform. This platform requires only 3 μL sample and has a linear detection range of 25 to 300 μmol/L with a limit of detection less than 16 μmol/L, which covers the normal range of lysine concentration in swine serum. We tested lysine concentration in swine serum using this platform with high accuracy, low sample consumption, and within 3 min. Together, these results may provide a rapid and portable platform for dynamic monitoring of swine lysine status and contribute to precise feed formula modulation with low-protein diet strategy.

 

　　論文2鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405654522001433